Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат

Электрическая МИКРОСКОПИЯ

Электрическая микроскопия – способ морфологического исследования объектов при помощи потока электронов, позволяющих изучить структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электрического микроскопа ЭМ прошла большой путь развития и позволила перейти на отменно новый уровень исследования материи. ЭМ отыскала обширное применение в морфологии, микробиологии Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат, вирусологии, биохимии, онкологии, мед генетике, иммунологии. Благодаря ЭМ раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неведомых ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток. ЭМ позволила осознать многие тонкие механизмы развития заболеваний, в том числе на ранешних шагах их появления, еще Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат до возникновения чёткой медицинской симптоматики.

ЭМ все обширнее применяется для ранешней диагностики болезней, также для выявления этиологии информационных процессов. Её употребляют в онкологии для определения гистогенеза опухолей, что имеет принципиальное значение в лечении и прогнозе онкологического заболевания. В нефрологии исследования при помощи ЭМ материала, приобретенного при пункционной биопсии, позволяет Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат выявить ранее морфологические конфигурации структур пачек, диагностировать форму гломерулонефрита и т.п. При ЭМ пунктатов печени удается провести дифференциальную диагностику гепатитов, гепатозов и других болезней печени, найти активность процесса и часто его этиологию.

Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются способностями разрешающей возможности электрических микроскопов. Внедрение ЭМ Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат в купе с другими способами, к примеру, с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими, определило возникновение электрической авторадиографии, электрической гистохимии, иммунной электрической микроскопии (электрической иммуноморфологии) и других. Это позволило существенно расширить информацию, получаемую при помощи ЭМ, следить структурное выражение течения биохимических процессов в клеточке, что, в свою очередь, подтвердило один из главных Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат методологических принципов современной биологии – диалектическое единство структуры и функции.

ЭМ просит специальной подготовки объектов исследования, от которой в значимой мере зависят способности способа. В согласовании с целями исследования методика таковой подготовки может быть различной. Но обязательным условием для всех электронно-микроскопических исследовательских работ является фиксация тканей либо Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат бактерий с наибольшим сохранением их прижизненного строения. Есть два принципно разных метода фиксации: хим и физический, любой из которых имеет разные варианты.

В ЭМ, обычно, употребляют хим фиксацию при помощи фиксаторов, владеющих стабилизирующими качествами. Универсального для всех тканей фиксатора не существует, потому зависимо от задачки определенного исследования используют надлежащие Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат фиксаторы. При выборе хим фиксаторов исходят из их возможности коагулировать белки (спирты, ацетон, некие кислоты, соли томных металлов и др.) или стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовоксильный калий и др.).

Для исследования берут биопсийный материал либо материал от трупа человека либо животных скоро после пришествия Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат погибели. Есть рациональные сроки взятия разных тканей и клеток, обычно исчисляемые минутками. Чем ранее ткань помешают в фиксатор, тем паче достоверные данные получают о прижизненной структуре клеток. Фиксаторы владеют различной скоростью проникания в ткань: от этого зависит вероятная величина объекта исследования. Так, четырехокись осмия и глутаровый альдегид попадают в ткань на 0,1-0,5 мм Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат приблизительно за 1 - 1,5 часа, но для неких тканей оно может быть увеличено до 4 часов либо до 20-30 мин. В отдельных случаях допускается в течение одних суток. Наибольшее распространение получила фиксация материала в глутаровом альдегиде с следующей дофиксацией в четырехокиси осмия. Глутаровый альдегид лучше, чем четырехокись осмия фиксирует белки, но ужаснее Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат выравнивает липиды, что и обуславливает использования обоих фиксаторов как дополняющих друг дружку.

Для избирательной фиксации отдельных субклеточных структур употребляют более специальные фиксаторы (перманганат калия, двухромовокислый калий и др.). Качество фиксации в значимой степени находится в зависимости от рН и осмотического давления фиксирующего раствора. Хорошим является рН 7,2-7,4, что соответствует Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат физиологическим характеристикам. Потому используют буферные смеси. Почаще используют фосфатные либо какодилатный буферы. Физиологическое осмотическое давление делают методом прибавления осмотически активных веществ, к примеру сахарозы либо неких солей.

Есть некоторое количество способов хим фиксации: перфузионный, когда фиксатор вводят в ток крови, фиксация на месте, когда фиксатор вводят в ткань до Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат ее иссечения, способ погружения иссеченных кусочков ткани в фиксатор. Для замедления аутолитических процессов, протекающих в иссеченных кусочков ткани до полной их фиксации, последнюю проводят при температуре 2-5 градусов.

После фиксации нужно выполнить обезвоживание ткани. Этот процесс должен быть относительно резвым, постепенным и совместно с тем обеспечить очень полное удаление воды из Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат эталона, что достигается проведением подлежащей исследованию ткани через батарею спиртов либо ацетонов восходящей концентрации (от 30 до 100%) в течение 1-го часа.

Последующим принципиальным шагом подготовки материала для ЭМ является заливка (заключение) тканей в заливочные среды с целью получения блока, владеющего хорошим сочетанием твердости и эластичности, позволяющим приготовить узкий срез Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат ткани (шириной более 100 нм), через который может пройти электрический луч. Первыми заливочными материалами были метилметакрилат и бутилметакрилат. В текущее время они практически не используются, т.к. токсичны и просто возгоняются под пучком электронов, что приводит к выраженным реликвиям и загрязнению электрического микроскопа. Более обширно для заливки тканей употребляют эпоксидные Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат смолы, в главном аралдит и эпон, нередко используемые вместе. Наименее всераспространены полиэфирные смолы (вестопал), водорастворимые заливочные консистенции, из которых почаще пользуются гликольметакрилатом и дуркупаном. Но, не одна заливочная среда не является химически инертной и в некий степени влияет на ткань: это нужно учесть при интерпретации результатов микрокопирования.

В последние годы Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат обширное применение отыскала заливка в так именуемые компаунды, т.е. в смесь определенных веществ: базу (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру крепкость и твердость, пластификатора, обеспечивающего упругость и упругость полимера, зачинателя, диссациирующего с образованием свободных радикалов, ускорителя, который, взаимодействуя с мономером, высвобождает активные дополнительные радикалы, и катализатора, содействующего началу Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат реакции полимеризации. В практике обычно употребляют компаунд, состоящий из базы, отвердителя, пластификатора и катализатора, роль которого может играть ускоритель либо зачинатель. Имеется довольно огромное количество методов пропитки ткани заливочными средствами. Процесс пропитки обычно протекает при комнатной температуре либо в термостате при температуре 30˚ в течение 48 часов. Потом куски ткани переносят Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат в маркированные желатиновые капсулы либо особые формы, заполненные заливочной консистенцией. Для полимеризации консистенции капсулы на 48 часов помещают в термостат при температуре 60˚. В итоге полимеризации появляется блок, владеющий надлежащими качествами.

Для получения ультратонких срезов шириной 30-50 нм употребляются стеклянные либо алмазные ножики. Алмазные ножики долговечнее стеклянных, но из-за высочайшей цены Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат они не получили широкого распространения.

К задней стороне ножика прикрепляют специальную ванночку и устанавливают на ультратом, в ванночку наливают 10% раствор этилового спирта и 10% раствор ацетона на дистиллированной воде. В подвижном держателе ультратома закрепляют блок с тканью. Резка блока осуществляется за счет поступательного движения стержня держателя, а подъем и опускание держателя относительно Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат режущей кромки ножика обеспечиваются электрической схемой. Обычно сначала изготовляют так именуемые тонкие срезы шириной 1 мкм, изучая которые, выбирают интересующий исследователя участок. Сориентируя подходящим образом полутонкий срез и блок, проводят заточку блока с таким расчетом, чтоб на верхушке образовавшийся пирамиды находился нужный участок. Потом изготовляют ультратонкие срезы шириной Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат 30-50 нм. Из ванночки срезы переносят на железные сетки.

Для констатирования срезов используют вещества с огромным атомным весом, такие как соли томных металлов, естественно рассеивающие электроны. Ионы неких из этих веществ могут создавать связи с кислородом и присоединятся к фосфатным группам нуклеиновых кислот. Другие, в особенности уранилацетат, кроме этого, действуют как Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат универсальные красители. Свинец связывается с комплексами ткани и осмиевыми факторами. Обычно проводят контрастирование ультратонких срезов либо соединяют контрастирование кусочков и ультратонких срезов ткани, после этого изучают в электрическом микроскопе.

Хим способы фиксации и заливки материала имеют ряд недочетов. Так, при их использовании происходят хим конфигурации макромолекулярной структуры клеток Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат: при фиксации и обезвоживании клеток и ткани теряют некие вещества: при содействии ткани, фиксатора и заливочной среды может изменяться локализация внутриклеточных структур. Потому активно разрабатываются физические способы изготовления ткани для ЭМ и в особенности гистохимии и цитохимии. Большая часть этих способов базирована на очень резвом замораживании кусочков ткани.

При Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат использовании способа замораживания-высушивания куски ткани помещают в хладагенты (пропан, изопентан либо фреон), охлажденные до -150˚, и в клеточках одномоментно прекращаются обменные процессы. При всем этом в ткани не успевают создаваться кристаллы льда, и потому субклеточные структуры не разрушаются, а вода перебегает в стекловидное состояние. Потом в высочайшем вакууме (10-6 –10-7 мм рт.ст Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат.) происходит сублимация, после этого в ткани особым образом заливают замороженные метакрилаты, аралдит либо вестопал В. Но, не всегда удается довольно стремительно умеренно заморозить ткань, а, как следует, стопроцентно избежать образования кристаллов льда, которые при увеличение температуры повреждают внутриклеточные структуры. Появляются и другие трудности, приводящие к возникновению Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат реликвий. Потому, почаще используют разновидность этого способа: замораживание-замещение. После замораживания воду, перешедшую в стекловидное состояние, убирают, помещая ткань в обезвоживающие вещества при низкой температуре. В этих критериях спирт и ацетон не достаточно оказывают влияние на структуру клеток. Способ криоскалывания (замораживание-травление) дает возможность избежать появления хим реакции при обработке тканей Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат. Куски тканей замораживают в хладагенте со скоростью превосходящей 1000˚ в 1 с. Объект помещают в вакуумную камеру и тем либо другим методом раскалывают либо разрывают. На поверхности скола наносят платиноуглеродное покрытие (реплику). Потом реплику очищают от органических остатков в растворе сильного окислителя, промывают в воде и помещают на сеточку для электрической Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат микроскопии.

Для исследовательских работ поверхности био тканей употребляют и способ оттенения. Наибольшее распространение получил способ изготовления реплик методом напыления в вакуумной камере углерода на поверхность эталона тканей. Для контрастирования образовавшейся высказывания на нее под острым углом напыляют электронно-плотные вещества (платину либо платиноиридиевый сплав). При всем этом количество атомов металла Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат существенно больше, по ту сторону контуров эталона, которая поближе к источнику напыления: при исследовании в электрическом микроскопе она смотрится неконтрастной. Обратная поверхность контура имеет не достаточно атомов металла: в электрическом микроскопе она контрастна и вроде бы оттеняет неконтрастную поверхность контура. Способ отражения позволяет высчитать высоту контуров Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат исследуемого объекта, потому что известен угол напыления, длина тени и роста, при котором выполнялось фотографирование высказывания в электрическом микроскопе.

Для исследования поверхности изолированных клеток и тканей служит сканирующая (растровая) ЭМ. Одним из главных условием изготовления объекта для сканирующей ЭМ является необходимость сохранения соответственного поверхностного натяжения клеток во избежание их деформации Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат. Поверхность изучаемой ткани промывают равновесными изотоническими забуференными солевыми смесями либо безбелковыми культуральными средами с рН 7,3-7,4, нагретыми до температуры 37˚. Для фиксации обычно используют изотонический раствор глутаровоальдегида с следующей дофиксацией четырехокисью осмия. Ткань обезвоживают в спиртах либо ацетонах, а потом высушивают способами замораживания-высушивания либо перехода критичной точки. Последний основан на использовании такового Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат физического явления как появление при определенных критериях критичного состояния равновесия пара и воды. При всем этом способе ткань оказывается в газовой среде (т.е. высушенной), что дает возможность избежать повреждающего деяния поверхностного натяжения. Для заслуги больших степеней разрешения увеличивают электропроводность объекта, напыляя на него томные металлы: золото Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат, платину, серебро либо их сплавы.

Применяется также способ ионной бомбардировки в вакууме пластинки металла ионами инертного газа. «Выбитые» атомы металла оседают на поверхности объекта исследования. Для выявления внутритканевых и внутриклеточных структур используют механические, тепловые, хим и другие способы.

Для ЭМ бактерий используют схожие способы с учетом строения бактерий Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат их размеров, осмотического давления и др. Особенный подход осуществляется при ЭМ вирусов. Исследование структур вирусов затруднено из-за малых размеров и слабенькой рассеивающей возможности вириона. На первых шагах ЭМ вирусов эта трудность преодолевалась оттененением частиц при испарении томных металлов в вакууме. Прямо до конца 50-ых годов 20 века методика оттенения Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат вирусных частиц была основной при исследовании вирусов в суспензиях. Почаще для этой методики использовали уран 238, платину, палладий либо сплавы платины с палладием. Наибольшее распространение получил сплав платины с палладием в соотношении 4:1. Зная данный угол оттенения, по длине образующейся тени определяют высоту вирусной частички и ее поперечник. Оттенение металлами исследуемого Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат объекта при сочетании с криогенными методиками (замораживание-высушивание) позволяет получить важную информацию при исследовании структуры вириона изометрических вирусов.

Обширное распространение получила методика негативного контрастирования вирусов при помощи вольфрамофосфорной кислоты (Н3 РW12 О40 ), которая при подщелачивании едким калием либо едким натрием (от значения рН 2,0 до рН 7,0) меняется и после нанесения продукта на вирус Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат делает зону высочайшего рассеивания электронов, в итоге чего выявляются морфологические признаки вируса.

Развитию познаний о структуре вириона содействовали криогенные методики. Один из простых вариантов таких методик заключается в последующем: сетки с подложкой и находящимися на их вирусами после нанесения контрастирующего раствора помещают в сжиженный пропан (температура -150˚) либо Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат переохлажденный азот (температура -200˚). Предстоящее высушивание эталона при температуре -100˚ в глубочайшем вакууме содействует сохранению трехмерной организации вириона. Исключение в этих критериях деформирующей роли сил поверхностного натяжения воды привело к пересмотру точки зрения, что форма вириона у липидосодержащих вирусов обладает высочайшей лабильностью. Более сложные криогенные методики, используемые в электрической микроскопии Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат (к примеру, криоскалывание), также занесли приметный вклад в развитие представлений о структуре вирионов, в особенности об имеющих липопротеидную оболочку.

Структура генома вирусов изучается при помощи измененной в 1959 году Клейштейном и Лангом методики оттенения линейных макромолекул томными металлами, которые испаряются с В-образным катодов под углом в 5-10˚.

Условием, позволяющим изучить нуклеиновые кислоты, и Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат в особенности однонические (поперечный размер 1-1,1 нм), является связывание их с основными белками, т.к. при всем этом образующийся нуклеопротеид имеет поперечник до 18 нм в двунитчатых структурах и до 15 нм – в однонитчатых. В качестве такового белка почаще употребляют цитохром С. Помещенная на подложку нуклеиновая кислота в белковом чехле имеет самый Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат необычный контур, и возможность узреть ее на всем протяжении осуществима исключительно в том случае, если во время оттенения металлами будет совершен хотя бы один поворот сетки с объектом для напыления на 360˚. Наилучшие результаты достигаются при продолжительном оттенении (до 10 минут) сплавом платины с палладием и неоднократном поворачивании напыленной Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат сетки на вращающемся столике.

Бессчетные модификации методики Клейшмидта и Ланга позволяют получать данные не только лишь о длине генома, но учить и степень гомологии генома разных вирусов, локализовать вставку того либо другого гена в состав гибридных молекул, изучить гибридные молекулы нуклеиновых кислот.

Общая информация о морфогенезе вирусов получена при помощи Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат ультратонких срезов вирусов. Техника получения ультратонких срезов вирусов не отличается от принятой.

В последние годы растет удельный вес ЭМ как экспресс-метода либо диагностики вирусных зараз. В особенности велика роль способа иммунной микроскопии, позволяющего установить родовую принадлежность вируса.

Иммунная ЭМ сыграла решающую роль на первых шагах исследования заразного гепатита Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат (гепатита А), также вирусных гастроэнтеритов и занесла значимый вклад в исследование гепатита В.

Теоретические базы иммуноморфологии на светооптическом уровне разработаны в 1942 году Кунсом с сотрудниками, которые в первый раз проявили, что в молекулу антитела можно ввести некие вещества, не нарушая значительно их специфики. Развитие этой идеи позволило в 1959 году Зингеру Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат создать иммунноморфологический способ на электронномикроскопическом уровне, основанный на внедрение антител, меченных ферритином. Ферритин-белок с высочайшим содержанием железа, в каком атомы металла организованны в 4 субъединицы, размещены близко друг к другу, что обеспечивает высочайшее рассеивание электронов при ЭМ и точное выявление молекулы.

Конъюгация белка с антителом вероятна при помощи Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат разных бифункциональных агентов, наибольшее распространение посреди которых получили 3,4-толуендиизоцианат и ксиленметадиизоцеанат. Иммунная электрическая микроскопия при помощи антител, меченных ферритином, эффективна для выявления экстрацеллярных антигенов бактерий в инфицированных тканях, в том числе вирусных антигенов на поверхности клеточки, также поверхностных антигенов в клеточке. Совместно с тем эта методика в ряде всевозможных случаев Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат неэффективна, к примеру, если нужно изучить внутриклеточные объекты, антигены бактерий снутри клеточки, что имеет место, сначала, при вирусных инфекциях. Это обосновано тем, что молекулярный вес (масса) антител, меченных ферритином, около 800 тыс., и потому проихождение их через плазматическую мембрану клеточки нереально, а антитела, меченные ферритином, проникшие через нее методом Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат эндоцитоза не вступают в контакт со специфичным антигеном. Потому основная масса исследовательских работ, связанная с выявлением внутриклеточных антигенов при помощи антител, меченных ферритином, выполнена при разрушении плазматической мембраны путей замораживания-оттаивания либо обработки комплиментом. Подмена ферритина низкомолекулярными соединениями, содержащими ртуть, йод, не отыскала широкого внедрения из-за Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат низкой специфики способа.

С конца 60-ых годов 20-го века в иммунологии применяется иммуннопероксидазная методика ЭМ для обнаружения антигенов снутри и на поверхности клеток. Перексидаза, применяемая для метки антител, позволяет получить лучший эффект по сопоставлению с другими ферментами (фосфотазы, некие оксидазы) благодаря более низкому молекулярному весу (около 40 тыс) и стойкости к разным гистологическим Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат процедурам. Антитела, меченные пероксидазой, попадают в клеточку и связываются с гомологичным антигеном. Конъюгирование антител с ферментом осуществляется рядом бифункциональных агентов, посреди которых более легкодоступным является глутаровый альдегид. После того как произошла связь антитела с подходящим антигеном, локализация фермента выявляется после контакта его с подходящим субстратом – бензидином Электронно-микроскопические методы исследования в медицине - реферат, а-нафтолом, консистенцией а-нафтола, с р-ферментом. В присутствии перекиси водорода появляется продукт с более выраженной рассеивающей способностью электронов по сопоставлению с окружающими структурами.


elektrosnabzhenie-promishlennih-predpriyatij-referat.html
elektrosnabzhenie-tom-ii-materiali-po-obosnovaniyu-proekta-generalnogo-plana-starinskogo-selskogo-poseleniya-poyasnitelnaya.html
elektrosnabzhenie-volgogradskoj-oblasti-vosstanovleno-na-kubani-raboti-prodolzhayutsya-informacionnoe-agentstvo-nakanuneru-14022011.html